2.4. Самосборка протобиополимеров
и свойства микросистем
Протобиополимеры, синтезированные в условиях холодной
плазмы, и в особенности смеси,богатые липидными структурамими, во время размораживания претерпевают самосборку в стабильные микросферы, однородные по размеру, от 10 до 50 мкм. Для их изучения были использованы следующие методы: оптическая микроскопия; электронная микроскопия, оптическая микроскопия в поляризованном свете; растровая электронная микроскопия, электронная микроскопия по методу замораживания-скалывания; проверка на устойчивость к термическому и световому воздействию, проверка на устойчивость по изменениям pH; испытание механической прочности; исследование мембранных свойств; изучение связывания биологически активных соединений.
Эти микросферы "выживают" в относительно суровых энергетических, термических и радиационных условиях; при нагревании до 80 градусов они подвергаются частичной дезорганизацией, после чего при охлаждении системы восстанавливаются. Такой же процесс происходит при облучении ультравиолетовыми лучами. Устойчивость микросфер в диапазоне рН 6...9 подтверждает предположение об их стабильности в первичном, как считается, щелочном океане.
Электрические измерения показывают, что микросферы обладают свойствами полупроводников и мембран. Определение удельного сопротивления как функции обратной абсолютной температуры свидетельствует о линейной зависимости, свойственной полупроводимости, а мембранный потенциал приближается к 30 мВ Последний был измерен между двумя фазами внутри и снаружи стенки микросферы путем введения во внутрь ее стеклянного микроэлектрода диаметром ~2 мкм, содержащего КС1 и имеющего внутреннее сопротивление порядка 5-15 МОм.
Электронно-микроскопические исследования срезов микросфер, окрашенных тетраоксидом осмия и залитых в метакриловую смолу, выявляют двухслойное строение стенки-мембраны.
Гипотетические протоклетки, как и первые живые клетки, нуждались в специальных образованиях (компартаментах) для удерживания водных растворов и взвесей; при анализе срезов методом трансмиссионной микроскопии такие образования выявлены. Исследование стенки-мембраны с помощью оптической микроскопии в поляризованном свете показало наличие надмолекулярной упорядоченности. Свечение объекта, находящегося в поле микроскопа, зависит от угла вращения плоскости поляризованного света, в то время как форма изображения определяется природой молекулярной организации. Как микрограммы со срезов проб, так и снимки, полученные в поляризованном свете, показывают, что мембрана является тонким жидким слоем типа жидкого кристалла.
Результаты, полученные растровой электронной микроскопией, содержат дополнительные данные о морфологических особенностях наружного слоя микросфер. Эллиптическая форма микрочастиц является следствием сплющивания их при напылении металла за счет испарения льда из внутренней части микросистемы. Сферы, содержащие воду (фактически лед, вследствие испарения в камере для напыления), деформируются при "высыхании", что указывает на существование во внутренней части микрочастиц полостей, в то время как наружная плотная структура имеет тенденцию к поддержанию первоначальной сферической формы.
На наружной поверхности структур выявлены протуберанцы - последствия разрыва мембраны при создании вакуума.
Снимки, полученные методом электронной микроскопии в сочетании с методом замораживания - скалывания, дают дополнительные доказательства наличия водных включений в микрочастицах. Указанная методика позволяет визуализировать наружный контур благодаря существованию поверхностей спайности и дает важные данные в отношении ультраструктуры стенки-мембраны. Приведены снимки (везде я убрал ссылки на фотки и сами фотки - неча эху захламлять
, кому надо, пойдет в библиотеку и ознакомится. замечание мое, ВП), полученные методом замораживания - скалывания, для сравнения нескольких препаратов микросфер, содержащих отдельные фосфолипидные везикулы. Наличие поверхностей спайности полусферической и полуэллиптической формы указывает на то, что гидрофобность молекул липидного типа отвечает условиям образования липидных мембран. Возникновение разрывов неправильной формы (вероятно, во время приготовления проб по методу замораживания - скалывания) является дополнительным свидетельством существования полостей в структуре микросфер.
Снимки стенок мембран при большем увеличении ясно демонстрируют образование надмолекулярной структуры. Микросферы избирательно захватывают биологически активные соединения путем инкапсулирования при намораживании водного раствора трипсина на охлажденную до-60°С цилиндрическую стенку реактора. После окончания реакции во время таяния льда спонтанно появляются микросферы, включившие в себя фермент.
Для изучения способности захватывать биологически активные соединения и последующей оценки их активности несколькими циклами промываний (производились повторные промывания и центрифугирования) были получены микросферы, содержащие трипсин. Установлено, что фермент может быть неоднократно использован для гидролиза белков. Были приготовлены следующие образцы: а) 2 мг суспензии предварительно промытых микросфер плюс трипсин (эталон); б) 2 мг суспензии микросфер, не содержащих трипсин; в) 2 мл воды, оставшейся от последнего промывания микросфер с инкапсулированным трипсином. К каждому образцу был добавлен 1 г бычьего сывороточного альбумина. Препараты, доведенные до рН 6,8, инкубировали в течение 5 ч при комнатной температуре, а полученные продукты гидролиза анализировали после отделения микросфер методом диск-электрофореза на полиакриламидном геле. По денситометрическим оценкам после окрашивания проявлялись полосы пептидного типа.
Гидролитическая активность проявляется только в препарате, содержащем помимо альбумина микросферы с инкапсулированным трипсином. Необходимо отметить, что эта система не теряет свойств при повторном использовании до трех циклов.
Использованные микросферы с инкапсулированным трипсином интенсивно промывали дистиллированной водой и снова использовали; они проявляют гидролитическую активность в отношении бычьего сывороточного альбумина. Как видно из рис. 77- 79, инкубация альбумина с микросферами, содержащими трипсин, приводит к гидролизу белка; этот процесс выражается в появлении новых максимумов, характерных для более "легких" белковых фракций (рис. 79).
Для изучения взаимодействия микросфер с инкапсулированным соединением с определенной биологической системой использовалась экспериментальная модель - лишенная оболочки яйцеклетка червя трубочника Tubifex. Эта клетка характеризуется спиральным типом дробления. Первое деление дробления особенно чувствительно к воздействию некоторых физико-химических факторов. В нормальных условиях первая плоскость первого деления дробления делит яйцеклетку Tubibex на два бластомера неодинаковых размеров (рис. 80): а - маленькая клетка, б - большая клетка.
Следующее деление (бластомера б) также асимметрично. Эта асимметрия является выражением цитоплазматической дифференцировки яйцеклетки, благодаря которой в процессе созревания появляются морфофункциональные градиенты. Физические или химические факторы, воздействуя в период дифференцировки клеток, приводят к формированию в результате деления двух клеток одинаковых размеров. Яйцеклетки, в которых плоскость первого деления симметрична, не развиваются в нормальные бластулы. Одновременно с дроблением происходит изменение клеточной оболочки, что позволяет установить, на какой стадии клеточного цикла находится данная клетка.
Такие процессы, характерные для периодов первого деления и предшествующего ему, были изучены на клетках, лишенных яйцевой оболочки (имеющих только плазматическую мембрану) и подвергнутых воздействию микросфер, не содержащих или содержащих инкапсулированный трипсин в концентрации, примененной ранее (1 мг трипсина на 250 мл суспензии микрочастиц).
Проба бычьего альбумина растворена в смеси трис + 0,0625 М НС1 (рН 6-8) + меркаптоэтанол 5% + + додецилсульфат натрия 3% + глицерин 10%. Разделение выполнено в стеклянных трубках длиной 10 см, заполненных полиакриламидным гелем с концентрацией 8,75% при постоянном токе 2 мА на трубку. После разделения (~2 ч) гели были окрашены 0,1%-ным раствором Кумасси голубого.
Для выявления возникающих новых явлений к яйцеклеткам, находящимся в 5 мл физиологического раствора, добавляли последовательно 2 капли суспензии микросфер, содержащих инкапсулированный или свободный трипсин либо не содержащих трипсина. В то время как в присутствии микросфер со свободным трипсином или без него деление яйцеклетки и развитие бластулы происходит нормально, микросферы, содержащие инкапсулированный трипсин, индуцируют видоизменение процессов, характерных для клеточной оболочки (интенсифицируют их), и в конечном итого блокируют сегментацию (рис. 81).
Микроскопическое исследование показывает, что микросферы, содержащие инкапсулированный трипсин, при контакте с мембранами включаются в клетки, по-видимому, путем эндоцитоза. Эту способность взаимодействовать с цитоплазматической оболочкой и проникать через нее можно объяснить только наличием трипсина внутри или на поверхности стенки мембраны микросфер. Эффект ингибирования дробления обусловлен, вероятно, высвобождением компонентов микрочастиц под действием внутриклеточных ферментов. Следовательно, клеточные ферменты способны воздействовать на соединения, синтезированные в абиогенных условиях и подвергшиеся самоорганизации в микросферы. Внутриклеточная деградация микросфер подтверждается также экспериментальными данными о том, что протобиополимеры, полученные в других абиотических условиях, также приводят к повышению активности оболочки и блокированию клеточного деления. В такой яйцеклетке, дробление которой блокировано инкапсулированными микросферами, цитолиз, т. е. гибель, наступает только через 48 ч, а это означает, что основные клеточные функции продолжаются.
2.5. Заключение
Экспериментальные результаты, полученные и интерпретированные в свете низкотемпературной теории, приводят к следующим фундаментальным выводам:
1. Холодная плазма - источник первичной энергии - могла играть существенную роль в ходе химической эволюции.
2. Наличие поверхностей с отрицательным температурным режимом на абиотической Земле представляло собой определяющий фактор для появления протобиополимеров. Макромолекулярные предшественники живой материи появились путем аккумулирования и рекомбинации активных частиц, возникших под влиянием плазмы в газообразной фазе (первичная атмосфера), на холодных поверхностях суши или в атмосфере.
3. Структурные и функциональные протобиополимеры генерировались одновременно и накапливались дифференцированно в зависимости от изменений состава первичной атмосферы. Их образование было результатом определенных рекомбинационных механизмов во время процесса таяния льда.
4. Основные компоненты имели макромолекулярную структуру (полипептиды, полисахариды и т. д.). Получение в модельных синтезах незначительного количества биомономеров (аминокислот, сахаров, оснований и т. д.) свидетельствует о том, что протобиополимеры предшествовали соединениям с малой молекулярной массой в хронологии их возникновения. Вещества этой категории образовались в процессах гидролиза и расщепления.
5. Смеси протобиополимеров, в особенности богатых гидрофобными производными, в структурном отношении соответствовали требованиям самоорганизации, группируясь в совокупности индивидуальных фазообособленных частиц. Эта ступень представляет собой скачок от химических смесей к организованным системам (протоклеткам).
6. Функционирование этих систем (с фазовым обособлением, мембранными, электрическими и др. свойствами) моделирует этап возникновения первичных переносчиков энергии и самых простых циклических процессов.
Эти соображения привели нас к созданию модели химической эволюции, представленной на рис. 82 [198, 199].
За исторически очень короткий, но чрезвычайно фактически насыщенный период накапливались знания и опыт, в результате чего выяснены условия отдаленного прошлого земной коры, которые могли привести к возникновению жизни. Сегодня мы находимся ближе, чем когда-либо, к наиболее высокой и важной цели человеческого знания: воспроизведению живой клетки в лаборатории. Химики могут синтезировать почти все предшественники жизни. Отталкиваясь от простых молекул и моделируя первоначальные условия Земли, мы приходим к макромолекулярным структурам вплоть до тех, которые находят биологи, проникая в сокровенные источники живой материи, и, возможно, еще до начала нового тысячелетия посредством гиперциклических процессов
* или другим путем [214] будет сделан этот гигантский качественный скачок, основанный на понимании и освоении энергетических механизмов в микросферах.
*гиперцикл - термин теории самоорганизации материи, разработанной лауреатом Нобелевской премии М. Эйгеном